Western Blot实验可以说是生物专业基础的实验了,WB实验出现多问题的,应该就是各种背景问题了。为什么明明跑出了想要的趋势,但就是背景脏?
这里要清楚一点，背景脏不一定是因为仪器不干净造成的,也有可能是蛋白降解或者整个实验过程中条件不合适造成的,有可能是以下的环节出了问题:
1、 实验准备
提取蛋白所需的研磨器材,以及制胶的玻璃板、梳子要清洗干净。
若长期不使用,建议器材在实验前再行清洗-次以杜绝相应的污染。
2.提取蛋白
选择台适的蛋白裂解液,充分去除一些干扰因素,比如核酸,多糖,脂类等。
建议蛋白在测量浓度后变性分装保存，避兔反复冻融使蛋白发生降解。
3、制胶
灌胶之前要将配好的试剂充分混匀,灌胶的过程中要掌握好速度,缓慢加入,避兔产生气泡。
灌注好分离胶后,缓缓加入无水Z醇封胶,该步操作时速度一定要慢 ,防止胶面被冲变形,在等待分离胶凝固的过程中,不要总去摇晃观察。
温度较高的情况下, 30min左右就会凝固,冬天气温较低可能需要较长时间。
若分离胶液面不平,会影响后期蛋白电泳的效果。
4.转膜
转膜前需在转膜板两侧各放置3-4张滤纸(两侧数量相同) 。
切记不要用手直接接触PVDF膜和滤纸,手上的油脂会对其造成污染,务必佩戴干净的手套,全程尽量使用镊子夹取。
转膜过程中海绵滤纸凝胶-PVDF膜滤纸海绵每-层的气泡要排空。
转膜时要使整个电转仪置于冰水混台物中,常用220V或者其他高电压进行。
机器温度升高,会使蛋白降解,也就是转膜后,用丽春红染色发现条带跑糊,发光后条带和背景也会脏的一塌糊涂。
5.孵育抗体
孵育一抗的时间大多会选择4°C过夜,也可以室温封闭2小时, 4°C过夜效果会比室温好, 4°C过夜具体多长时间算合适,其实没有硬性规定。二抗孵育的时间不宜过长, -般是室温下摇床孵育1~2小时,抗体孵育完成后要清洗干净,特别是二抗孵育完成后 ,否则可能导致显影结果出现高背景。
