胰酶消化法培养平滑肌细胞的具体操作步骤

胰酶消化法培养平滑肌细胞
1.1　试剂和动物
胰酶购自Sigma公司；α-actin抗体购自上海恒远生化有限公司；PBS液各成分均为市售分析纯；新生小牛血清购自HyClone；DMEM 为Gibco产品。雄性Wistar大鼠（2只，体重175±25 g）购自中国医学科学院实验动物中心。
1.2　胰酶消化法原代培养
Wistar大鼠处死，迅速取出胸主动脉，浸泡在含无菌PBS的表面皿中，转移到无菌超净台。在表面皿中漂洗主动脉去除残留的血迹，纵向剪开主动脉，把主动脉铺平并使内膜朝上，用镊子来回刮除内膜层，剥离血管中膜。将剥离的血管中膜用眼科剪剪碎，碎片大小在1 mm×1 mm左右。装入含0.25%胰酶的玻璃培养瓶中于37℃条件下消化。当在显微镜下观察组织块表面出现大量细胞时应立即加入血清终止消化，一般消化的时间在 3.5 h。终止消化后将玻璃培养瓶置于37℃空气摇床振摇10 min，继续用吹打的方法使组织块表面的细胞尽可能脱落。待细胞从组织块脱离后，120目细胞筛过滤，转入离心管内离心，弃上清，用含20%小牛血清的 DMEM培养基吹打细胞，zui后接种于25 mL培养瓶，放入CO₂孵箱培养，48 h后换液。
1.3　传代培养
细胞融合后，倒去旧的培养液，加入适量的0.25%胰酶，显微镜下观察，见细胞收缩后去除消化液，加入适量培养液，吹打细胞，以1∶2接种于新培养瓶中，补足培养液，放入37℃、5%CO₂孵箱培养。传代细胞从第三代开始可换用含10%小牛血清的DMEM培养基培养。VSMC 至少可以传16代以上，并且从第二代开始平滑肌细胞即可冻存。
1.4　动脉平滑肌细胞的鉴定

相差显微镜下，细胞未汇合之前多数呈梭形，至汇合后，部分区域细胞束状排列，呈典型的“峰和谷”状态。将传代获得的平滑肌细胞接种于盖玻片上，3~4天后至亚汇合状态，取出细胞爬片，PBS清洗后用4℃纯丙酮固定15~30 min，自然晾干。采用小鼠抗大鼠α-肌动蛋白抗体免疫组织化学染色鉴定VSMC肌动蛋白。根据S-P免疫组织化学染色的常规方法，以平滑肌细胞胞浆棕黄色为阳性结果。
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