与其他植物病毒的血清学检测方法相比较，ELISA的突出优点在于：1. 灵敏度高，检测浓度可达 1-10 ng/mL。2. 专化性强、重复性好。3. 快速、结果可以在几个小时内得到。4. 检测对象广，一般不受抗原形态的影响。5. 适用于处理大批样 品。6. 具有自动化及试剂盒的发展潜力。
ELISA 从种类上可归为“直接”和“间接”两种。直接法就将抗原吸附在一个固相上，用酶标记特异抗体直接检测；间接法就是先用没标记的特异抗体于固相上的抗原结合，采用标记的“第二抗体”（即抗特异抗体的结合物） 或 A 蛋白为结合物测抗原。这两种方法都是将抗原本身通过静电吸引结合在固相上（即抗原包被），或被事先吸附在固相上的特异抗体或抗体片段选择诱捕。
ELISA实验有多种方法：直接法（Direct method）；间接法（Indirect method）；双抗夹心法（Double antibody sandwich method）; 酶标 A 蛋白双抗夹心法；酶抗酶（Enzyme-anti-enzyme method）；异种动物抗体双夹心法；青霉素 （Penicillinase）酶系统；生物素（Biotin）- 亲和素（Avidin）酶系统等。
一. 目的
ELISA试验方法是用于检测植物病毒zui广泛的血清学方法之一。之中，的为双抗体夹心法（DAS ），灵敏度及专化性都令人满意。在 ELISA中免疫专化性通过相结合的酶与合适的底物反应表现出来。通过本实验掌握zui典型的双抗体夹心法的原理及技术。
二.实验材料及用具
1.ELISA板，聚苯乙烯（PVC ）板均可用，板孔根据酶标仪设计程序采用40孔或96孔。
2.特异性抗体免疫球蛋白IgG或F（ab’）2 。
3.酶标记抗体免疫球蛋白IgG（用HRP或ALP酶标记）。
4.感染病毒的病株及健康植株。
5.微量取液器（40-200 μL可调，1000uL可调，20uL可调）；洗瓶。
6.酶联免疫检测仪,台式离心机,冰箱。
7.包被缓冲液；洗涤缓冲液；IgG 稀释缓冲液；底物溶液；邻苯二胺（OPD）；过氧化氢（H2O2 ）；2M硫酸。
8.10mL、200mL量筒；5mL、10mL、100mL、500mL烧杯；50mL三角瓶；100mL、500mL容量瓶；研钵；记号笔；小塑料袋；2-5mL可调洗涤瓶。
三.缓冲液的配制
1.磷酸缓冲液：用0.02M PBS（pH=7.4），可以配成0.1M，用时稀释5倍使用。
2.洗涤缓冲液：用 0.02M PBS 缓冲液（pH=7.4）及 Tween20 配制。PBS－Tween缓冲液＝1000mL PBS+0.5mL Tween20。
3.包被缓冲液：0.05M碳酸盐缓冲液（pH=9.6） ,4℃保存。
4.酶标抗体稀释缓冲液：1000mL PBS-T+1％牛血清白蛋白（BSA ）
5.底物溶液：磷酸－柠檬酸缓冲液（pH=5.0）
6.终止液：2-4mol/L H2SO4
四.实验步骤（用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体IgG步骤）
1.包被抗体：在酶联板每孔中加入200 μL适宜浓度特异性抗体免疫球蛋白液（用包被缓冲液稀释：0.1M pH=9.0碳酸盐缓冲液）。加盖以防蒸发，置 37℃下孵育2-4小时或4℃下过夜。
2.洗涤、封闭：甩净孔中溶液，用PBS-Tween（0.02M pH=7.4磷酸缓冲液＋Tween-20）冲洗反应孔，室温静置3-5分钟后再冲洗，共重复三次。注意排除气泡。
3.加待检的抗原标样：每孔加200μL待测样品，同时设阳性、阴性及空白对照。抗原稀释液为PBS-T液。加盖4℃下孵育过夜或37℃ 4-6小时。
4.洗涤：方法同上，重复三次。
5.酶标记抗体：每孔加入适宜浓度的特异性酶标记抗体 IgG 200 μL,30℃下孵育3-6小时（酶标记抗体稀释液为PBS-T＋0.1％牛血清白蛋白）。
6.洗涤：方法同上，重复三次。
7.加底物溶液：加入200 μL新配制的底物液，室温下孵育0.2-1小时或直至显色到所需程度。
8. 终止反应：用50 μL适当的终止液终止反应。如底物为OPD（ 或TMB），则用2M H2SO4终止。底物为pNPP用3M NaOH终止。
9.观察结果：用肉眼观察颜色反应，并以颜色深浅记录+++，++，+，±，-或用酶联检测仪测定（O.D）吸收值。判断结果。
