Dyn,人强啡肽酶联免疫试剂盒技术指导
l 本试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中人强啡肽(Dyn)的含量。
l 有效期:6个月
l 保存条件:2-8℃
l 本试剂盒仅供体外研究使用,不用于临床诊断
实验原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被人强啡肽(Dyn)捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并*洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的人强啡肽(Dyn)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。
Dyn,人强啡肽酶联免疫试剂盒技术指导需要而未提供的试剂和器材
1. 37℃恒温箱。
2. 标准规格酶标仪。
3. 自动洗板机。
4. 单通道或多通道可调节移液器以及其吸头。
5. 蒸馏水,容量瓶等
6. 干净的试管和Eppendof管。
注意事项
1. 从-20℃取出的试剂盒,在4℃解冻guoye。盒内每一瓶解冻的溶液在开启瓶盖之前都要轻轻摇匀,避免解冻时出现的分层,否则会出现浓度不均一的现象。
2. 开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。
3. 配制各种试剂时,切记混匀!
4. 用户在初次使用试剂盒时,应将各种试剂管离心数分钟,以便试剂集中到管底。
5. 建议所有标准品、样本都做双份检测。
6. 要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活!
7. 为免交叉污染,要避免重复使用手中的吸头和试管。
洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的PBS或TBS洗涤缓冲液至少0.35ml注入孔内,浸泡1-2分钟。根据需要,重复此过程数次。
自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
样品的准备和保存
样品如果不立即分析,应分装后冷冻保存,且避免反复冻融。
血清——用干净试管收集血液,室温凝固2小时或4℃guoye,离心1000×g 10分钟,收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
细胞培养、组织匀浆、体液——离心去除沉淀,立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
样品稀释的一般原则
用户须查阅文献了解标本内待测因子的含量,决定适当的稀释倍数,以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的*检测范围。样品的稀释应有详细记录。
试剂的准备和保存
A. 标准品的稀释和使用:在使用前2小时内准备。将冻干品管内加入1ml样品稀释液,*溶解后做倍比稀释。
8稀释后的标准品在2小时内使用。
B.生物素标记抗体工作液:在使用前2小时内准备。
1. 根据每孔需要0.1ml计算总的用量(实际配制时应多配制0.1-0.2ml)。
2.按10ul生物素标记抗体稀释液990ul的比例配制工作液。轻轻混匀。
C.亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)工作液的准备:在使用前1小时内准备。
1.根据每孔需要0.1ml计算总的用量(实配时应多配制0.1-0.2ml)。
2.按10ul亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)加ABC稀释液990ul的比例配制工作液。轻轻混匀。
D. TMB显色工作液的准备:在使用之前30分钟,按TMB显色液A 9份加 TMB显色液B 1份的比例配制TMB显色工作液。
操作程序
1. 确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目。
2. 将倍比稀释的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中,1孔只加样品稀释液的作为对照。处理后的标本按100ul每孔加入。
3. 酶标板加上盖,37℃反应90分钟。
4. 反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体;或甩去酶标板内液体,再对着吸水纸拍几下。洗涤2次。
5. 将准备好的生物素抗体工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反应60分钟。
6. 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤3次,每次浸泡1分钟左右。
7. 将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反应30分钟。
8. 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤5次,每次浸泡1-2分钟左右。
9. 按每孔0.1ml依次加入TMB显色工作液,37℃避光反应,反应过程中,要经常的观察,当肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔差别不明显时,即可加入TMB终止液0.1ml/孔。(显色反应zui长不要超过30分钟)。
10. 用酶标仪在450nm测定O.D.值。
11. 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了N倍,其实际浓度应该×N。