LF,人脂褐质酶联免疫试剂盒技术指导
l 本试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中人脂褐质(LF)的含量。
l 有效期:6个月
l 保存条件:2-8℃
l 本试剂盒仅供体外研究使用,不用于临床诊断
实验原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被人脂褐质(LF)捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并*洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的人脂褐质(LF)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。
LF,人脂褐质酶联免疫试剂盒技术指导的类型
ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂:(1)固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);(2)酶标记的抗原或抗体,称为"结合物"(conjugate);(3)酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不同类型的检测方法。
双抗体夹心法是检测抗原zui常用的方法,操作步骤如下:
1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2) 加受检标本,保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
3) 加酶标抗体,保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。*洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
4) 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色,测知标本中抗原的量。在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测。
在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同(参见1.3.2,图1-4),如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的zui高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰。RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应。采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心。
样品要求
·客户需提供待检测抗体和包被用抗原。
·检测的样本为细胞培养上清、人和动物的血清、血浆。
·样本收集后应立即-20℃保存,若长期保存应-70℃。
·样本量的要求:若一个指标做复孔检测应不少于250ul,做单孔检测应不少于120ul。建 议若客户样本量充足提供500ul以上。
·客户的样本收集后,立即按要求保存,切忌反复冻融。外地客户邮寄需要用干冰运输。邮寄前请与沟通确认。